Celovit opis metode verižne reakcije s polimerazo

Polimerazna verižna reakcija (PCR) je ustvarjanje več kopij kratkega dela človeške DNA. Majhna količina fiziološkega materiala je potrebna za raziskave in doseganje rezultatov: izpljunek, kri, plodovnica, slina, urin itd.

Kaj je verižna reakcija s polimerazo?

Metodo PCR je razvil ameriški znanstvenik Melison, ki je leta 1998 prejel Nobelovo nagrado za svoj razvoj. Aktivno uporabljeno:

• z zgodnjim odkrivanjem okužb, onkološkimi boleznimi;
• v forenzični preiskavi za preučevanje izredno majhne količine DNA;
• v veterinarstvu, biologiji, molekularni genetiki;
• za osebno identifikacijo z DNK;
• potrditi očetovstvo;
• v ekologiji, na primer, ko sledimo kakovosti izdelka, v antropologiji.

Kdo je predpisan PCR?

Polimerazna verižna reakcija pri diagnosticiranju infekcijskih bolezni je ena najbolj zanesljivih metod, ki daje najbolj natančno in zanesljivo analizo. Na primer, zanesljivost analize na klamidijo je blizu 100%. Najpogosteje je ta diagnostični ukrep predpisan bolnikom, ki med testom težko prepoznajo določenega patogena.

Uporabite PCR laboratorijske teste:

1. Za iskanje patogenih organizmov, ki povzročajo okužbo sečil in genitalnega trakta, je težko identificirati pri uporabi pridelkov ali metode imunologije.
2. Za ponovno analizo okužbe s HIV na začetni stopnji s pozitivnim, vendar vprašljivim rezultatom začetne analize, na primer pri novorojenčkih iz okuženih staršev.
3. Vzpostavitev onkološke patologije v zgodnji fazi in za individualno korekcijo zdravljenja pri bolnikih.
4. Za zgodnje odkrivanje in potencialno zdravljenje dednih patologij. Mnogi bodoči starši preizkušajo, ali so nosilci genetskih bolezni. Pri otrocih ta metoda določa verjetnost izpostavljenosti boleznim, ki so podedovane.

Tudi ta tehnika se uporablja:

• za odkrivanje patologije ploda v zgodnji nosečnosti;
• pri bolnikih pred operacijo za presaditev organa - potrebno za določitev združljivosti tkiv
• zaznavanje nevarnih patogenov v krvi darovalca;
• pri novorojenčkih za odkrivanje skritih okužb;
• za oceno rezultatov protivirusnega ali protimikrobnega zdravljenja.

Zakaj gre skozi ta postopek?

Ker PCR velja za zelo učinkovito diagnostično metodo, ki daje skoraj 100% rezultatov, se ta postopek uporablja:

1. Za potrditev ali izključitev diagnoze.
2. Za hitro oceno učinkovitosti zdravljenja.
3. V mnogih primerih se ta metoda šteje za edini možni način za odkrivanje razvojne patologije, če so se druge bakteriološke, virološke tehnike izkazale za neuporabne.
4. Virusi, ki uporabljajo postopek PCR, so odkriti takoj po okužbi in pred nastopom glavnih simptomov.
5. Zgodnje odkrivanje mikroorganizmov bo omogočilo takojšnje zdravljenje.

Poleg tega bo analiza PCR omogočila hitro zaznavanje majhnega števila mikroorganizmov v živih ali mrtvih vzorcih. Zato se ta tehnika uporablja za iskanje specifičnega patogenega organizma, npr. Tuberkuloškega bacila.

Poleg tega se uporablja analiza PCR:

• za določanje občutljivosti DNA na določene vrste antibiotikov, kar bo omogočilo čim hitrejše začetek zdravljenja;
• nadzor nad širjenjem epidemij;
• za identifikacijo in sledenje novih vrst mikrobov, patogenov.

Glavne vrste PCR

Standardna metoda

Analiza PCR izvedemo na podlagi večkratnega podvajanja specifičnega fragmenta DNA in RNA z uporabo temeljnih encimov. Zaradi tega raziskovalec prejme potrebno količino materiala.

PCR v realnem času

Pri tej vrsti raziskav se postopek identifikacije danega fragmenta začne po prehodu skozi vsak cikel. Tovrstna raziskava omogoča pridobitev informacij o številu virusov in mikroorganizmov v telesu, to je za izvedbo kvantitativne analize.

Način povratne transkripcije iz PCR

Ta analiza se uporablja za iskanje enoverižne RNA za nadaljnje odkrivanje virusov, katerih genetska osnova se imenuje RNA. To je na primer virus hepatitisa C, imunska pomanjkljivost itd. Pri izvajanju te študije se uporablja poseben encim, zaradi katerega je zgrajena enoverižna DNA. Sistem nato obnovi drugi sklop DNK in izvede tradicionalni postopek.

Indikacije za

Postopek PCR se uporablja na klinikah za nalezljive bolezni, porodništvu, urologiji, ginekologiji in nefrologiji, pediatriji itd. Najpogostejše indikacije za analizo dodelitve so naslednje: t

• ugotoviti tveganje za razvoj genetskih nepravilnosti pri otroku ob prisotnosti dednih patologij;
• diagnosticirati oba starša pri načrtovanju nosečnosti ali kadar je mati v težkem stanju med nosečnostjo otroka;
• s težavami spočetja pri ugotavljanju vzrokov neplodnosti;
• v primeru suma spolnih okužb v akutni fazi ali v nevarnosti, da preidejo v kronično fazo;
• zaznavanje vzrokov vnetnih procesov neznanega izvora;
• z nezaščitenim priložnostnim seksom;
• za določanje občutljivosti patogenega mikroorganizma na določeno zdravilo;
• sum na latentno okužbo za odkrivanje patogenov brez očitnih simptomov;
• potrditev okrevanja po bolezni, to je retrospektivna diagnoza.

Tudi PCR se uporablja, kadar je potrebno natančno določiti patogene kot so: virusi hepatitisa, človeška imunska pomanjkljivost, citomegalovirus, virus herpes simplex, virus rdečk, papiloma virus.

Tam se ta metoda uporablja za ugotavljanje okužb: infekcijska mononukleoza, klopni encefalitis, kandidiaza, ki jo povzročajo glivice candide, genitalne okužbe in tuberkuloza.

Če kontraindikacije in varne metode?

Ker se ta postopek izvaja brez vpliva na telo in se uporablja le biološki material, ki ga jemljemo za raziskave, ni kontraindikacij zaradi odsotnosti potencialne nevarnosti za telo. Na primer, vzorčenje biomateriala materničnega kanala ne poteka po kolposkopiji. Dajanje razmaza, ostružki so dovoljeni le 4-7 dni po koncu menstruacije in popolno prenehanje izcedka.

Značilnosti priprave za postopek

Kot vzorec za analizo PCR, pri katerem se odkrije DNK tujega patogena, se uporabi biološka tekočina ali tkivo. Vnos preskusne snovi poteka v obliki krvnega vzorčenja iz vene, strganja iz nosne votline, grla, materničnega vratu, sečnice. Pred diagnostičnim postopkom mora zdravnik bolniku razložiti, kateri material bo uporabljen:

• pri analizi okužb s herpesom mononukleoza opravi analizo urina, kakor tudi razmaz iz žrela;
• pri testiranju na hepatitis ali toksoplazmozo se iz vene odvzame kri;
• za diagnosticiranje različnih vrst poškodb centralnega živčevja se odvzame cerebrospinalna tekočina;
• v pulmologiji so vzorci za PCR analizo plevralna tekočina in sputum;
• če opravi študijo o intrauterinih okužbah med nosečnostjo, se za analizo uporabijo plodovnice.

Zanesljivost in natančnost rezultatov sta odvisna od sterilnosti in pogojev za jemanje biomateriala. Ker so študije PCR zelo občutljive, lahko vsaka kontaminacija sprejete snovi izkrivlja rezultate. Kompetentna priprava za dostavo biomateriala bolniku ne povzroča težav.

Vendar pa obstajajo številna priporočila:

• pri analizi spolno prenosljivih okužb je treba izključiti intimne stike tri dni pred dostavo materiala;
• 72 ur mora ustaviti uporabo vseh vaginalnih pripravkov;
• od večera prejšnjega dne ni mogoče izvesti higiene preučevanih območij
• 3-4 ure pred jemanjem vzorca iz sečnice je treba izločiti uriniranje;
• mesec dni pred začetkom testov morate prenehati jemati antibiotike;
• pred jedo in pitjem se daje kri zjutraj na prazen želodec;
• Jutranji urin se po odhodu na stranišče zbira v sterilni posodi.

Kako je PCR?

Pri izvajanju raziskav v posebnem reaktorju se določen cikel ponovi:

1. Prvi korak. Denaturacija. V aplikator se dajo slina, kri, ginekološki testi in druge snovi, kjer se material segreje in DNA razdeli na dve verigi.
2. Drugi korak. Rahlo hlajenje prevzete snovi, dodajanje posebnih sestavin, ki prepoznajo potrebne molekule DTC in se vežejo nanj.
3. 3 korak. Raztezek Med procesom se dokonča del DTC patogenega organizma, oblikuje se njegova kopija. Ta cikel se ponovi, kar podvoji kopijo specifičnega fragmenta DNA.

V nekaj urah nastane veliko kopij tega fragmenta, razkrije se njihova prisotnost v vzorcih. Nato rezultate primerjamo z bazami podatkov o različnih vrstah patogenov. To vam omogoča, da določite vrsto okužbe.

Značilnosti dekodiranja analize?

Končni rezultat študije bo bolniku dan več dni po biološki analizi.

Kvalitativna analiza

Negativni rezultat v tem primeru pomeni, da v tekočini, ki je bila predložena za testiranje, niso odkrili infekcijskega povzročitelja. Pozitiven rezultat kaže na odkrivanje patogenih virusov ali bakterij v biološkem vzorcu. Če je bil rezultat pozitiven, vendar hkrati oseba nima znakov aktivacije okužbe, se takšno stanje telesa imenuje asimptomatsko zdrav nosilec.

Najpogosteje se to opazi pri jemanju biomateriala v virusne patologije. V tem primeru zdravljenje ni potrebno, vendar zahteva stalen zdravstveni nadzor. Ker v takih pogojih obstaja verjetnost:

• širjenje virusa od nosilca na zdrave ljudi;
• aktiviranje procesa in prehod patologije v kronično obliko.

Kvantitativna analiza

Kvantitativni rezultat določi strokovnjak posebej za določeno vrsto okužbe. Na podlagi dobljenih rezultatov je mogoče oceniti stopnjo razvoja, stopnjo patologije, ki omogoča, da se zdravljenje čim hitreje predpiše.